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Brunfels, von 1514 bis 1521 Mitglied eines strengen Ordens, verließ das Kloster, nachdem er mit mehreren Humanisten seiner Zeit Kontakt pflegte. Er diente allerdings noch drei weitere Jahre als Priester in Steinbach der Kirche bevor er 1524 in Straßburg eine Schule eröffnete. Seine Laufbahn als Theologe und Philosoph war geprägt von Konflikten, so dass er 1530 an der Universität Basel Medizin studierte. 1532 trat er eine Stelle als Arzt in Bern an. Dort lebte er noch zwei Jahre bis zu seinem frühen Tod 1534.
Seine ersten Kontakt zur Botanik verdankt er angeblich Nikolaus Gerbel, den er 1519 kennenlernte und der ihm über die Heilkraft von Kräutern berichtete. Zu seinen Arbeiten gehören das dreiteilige Werk »Herbarum vivae eicones« (1530-40) und das zweiteilige Werk »Contrafayt Kräuterbuch« (1532-1537), Sammlungen von Texten und Zeichnung über Pflanzen, wobei der Schwerpunkt weniger auf der wissenschaftlichen Erkenntnis als auf einer Auflistung der den Pflanzen damals angedichteten Eigenschaften liegt. Die Zeichnungen bestechen durch ihre detailgetreue und realistische Darstellung und gelten als Grundlage für die Entwicklung der modernen Pflanzenbestimmung. Sie beeinflußten viele nachkommende Generationen von Pflanzen-Illustratoren.